surePAGE預(yù)制膠使用說(shuō)明書(shū)
發(fā)布時(shí)間：2020-12-09 07:47:10 點(diǎn)擊：
簡(jiǎn)介：SurePAGE 預(yù)制膠是Express Plus 的升級(jí)產(chǎn)品，它是一款高性能的小型聚丙烯酰胺凝膠，能滿足客戶上樣量大的需求。其獨(dú)特的膠板設(shè)計(jì)可以提高條帶分辨率，改善樣品在上樣孔里的分布狀態(tài)，使得條帶更加均勻。該預(yù)制膠為Bis-Tris 凝膠緩沖系統(tǒng)，比常規(guī)的 Tris-Glycine 系統(tǒng)具有更強(qiáng)的緩沖能力， 于pH6.4 的弱酸性條件下灌注，能夠更好地減少聚丙烯酰胺的降解，提高凝膠穩(wěn)定性。
SurePAGE 預(yù)制膠不含有 SDS，依賴(lài)于采用合適的電泳緩沖液和相應(yīng)試劑，是 SDS-PAGE 和非變性凝膠電泳的理想材料。依賴(lài)特有的灌注技術(shù)可以保證預(yù)制膠批次間穩(wěn)定性和條帶分布一致性。SurePAGE 預(yù)制膠配套使用 Tris-MOPS 或 Tris-MES 電泳緩沖液，能夠?qū)崿F(xiàn)高效、可靠地分離蛋白質(zhì)，便于后續(xù)染色或轉(zhuǎn)膜檢測(cè)。
SurePAGE 預(yù)制膠提供不同濃度的梯度膠和固定濃度膠。梯度膠的濃度包括4-20%、4-12% 和8- 16%；固定濃度膠包括8%、10%和12%。每種濃度的預(yù)制膠都有10個(gè)點(diǎn)樣孔、12個(gè)點(diǎn)樣孔和15個(gè)點(diǎn)樣孔三種規(guī)格。膠板尺寸：長(zhǎng)×寬×高為100 × 80 ×4.7 mm；凝膠尺寸：長(zhǎng)×寬×厚為80×70×1 mm。
主要特點(diǎn):
- 上樣量大 — 最大上樣量可達(dá)80 μl, 高于其他公司同類(lèi)產(chǎn)品
- 簡(jiǎn)單易用 — 特殊上樣口設(shè)計(jì)，使用普通10 μl 移液槍頭快速上樣
- 高分辨率 — 蛋白條帶分離更為清晰和均一
- 超長(zhǎng)保質(zhì)期 —2-8 ℃可保存12個(gè)月
- 兼容性膠板設(shè)計(jì) — 適合大多數(shù)小型電泳槽
- 重復(fù)性高 —不同批次預(yù)制膠的一致性好
- 物美價(jià)廉 — 節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本
1、凝膠選擇指導(dǎo)
表1. 凝膠選擇指導(dǎo)
| 產(chǎn)品編號(hào) |
丙烯酰胺濃度 |
孔數(shù) |
上樣孔體積 |
電泳緩沖液 |
轉(zhuǎn)移緩沖液 |
分離范圍 |
| M00661 |
8% |
10 |
80 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
180-20 kDa |
| M00664 |
10% |
10 |
80 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
160-20 kDa |
| M00667 |
12% |
10 |
80 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
120-6.5 kDa |
| M00655 |
4-20% |
10 |
80 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
250-10 kDa |
| M00658 |
8-16% |
10 |
80 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
160-10 kDa |
| M00652 |
4-12% |
10 |
80 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
250-20 kDa |
| M00662 |
8% |
12 |
60 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
180-20 kDa |
| M00665 |
10% |
12 |
60 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
160-20 kDa |
| M00668 |
12% |
12 |
60 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
120-6.5 kDa |
| M00656 |
4-20% |
12 |
60 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
250-10 kDa |
| M00659 |
8-16% |
12 |
60 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
160-10 kDa |
| M00653 |
4-12% |
12 |
60 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
250-20 kDa |
| M00663 |
8% |
15 |
40 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
180-20 kDa |
| M00666 |
10% |
15 |
40 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
160-20 kDa |
| M00669 |
12% |
15 |
40 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
120-6.5 kDa |
| M00657 |
4-20% |
15 |
40 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
250-10 kDa |
| M00660 |
8-16% |
15 |
40 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
160-10 kDa |
| M00654 |
4-12% |
15 |
40 μl |
MOPS, MES |
Tris-Bicine |
250-20 kDa |
下圖的蛋白遷移表可以幫助您選擇合適的凝膠進(jìn)行蛋白電泳
2、.可兼容電泳槽
SurePAGE 預(yù)制膠可兼容以下電泳槽：
3、SurePAGE 預(yù)制膠的使用簡(jiǎn)介
A.電泳緩沖液和電泳槽的準(zhǔn)備
- 取一包電泳緩沖液粉末 (Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder，產(chǎn)品編號(hào)：M00138) 溶解在 1 L 的去離子水中制成 1×電泳緩沖液。
- 將 SurePAGE 預(yù)制膠從包裝袋中取出，撕掉膠板底部的膠帶（見(jiàn)圖 1）
- 平穩(wěn)地將梳子從膠板中推出（見(jiàn)圖 2）
- 將膠板放入凝膠電泳裝置中。請(qǐng)參閱電泳裝置制造商的使用說(shuō)明。 Bio-Rad Mini-PROTEAN® Tetra System 電泳槽的使用注意事項(xiàng): 將電泳槽內(nèi)框架的綠色硅橡膠密封條取出，然后將其平坦的一面朝外并重新插回內(nèi)框架的凹槽中（見(jiàn)圖3）。
圖3. SurePAGE 預(yù)制膠在Bio-Rad Mini-PROTEAN
® Tetra System 電泳槽中的使用
圖 4. SurePAGE 預(yù)制膠在 Bio-Rad 電泳槽的使用
5、在電泳槽的內(nèi)槽中倒入足夠的 1× MOPS 或 MES 電泳緩沖液使其覆蓋上樣孔 5-7 mm，在外槽中加入相同的電泳緩沖液以確保適當(dāng)?shù)睦鋮s。為了獲得最好的效果，外槽的緩沖液需要加到與內(nèi)槽持平的位置或稍低，但不可漫過(guò)膠板（
注意：1. 相對(duì)于 MOPS 電泳緩沖液來(lái)說(shuō)，MES 更適合用于小蛋白的分離；2.Tris-Glycine 電泳緩沖液與SurePAGE 預(yù)制膠的 Bis-Tris 緩沖系統(tǒng)不兼容， 請(qǐng)不要使用。）
6、使用注射器或其他工具吸取適量 1×的電泳緩沖液，將上樣孔輕輕沖洗干凈，去除氣泡和殘留的儲(chǔ)存緩沖液。
B.樣品的制備
SDS-PAGE凝膠電泳
5x Loading Buffer配方 |
| SDS |
1.0 g |
| 甘油 |
5.0 ml |
| 溴酚藍(lán) |
25 mg |
| Tris base |
150 mg |
| β-巰基乙醇 |
1.0 ml |
| 去離子水 (使用 8 M NaOH或8 M HCl調(diào) pH 至6.8) |
加至10 ml |
10x MES 電泳緩沖液配方: |
| Tris base |
60.6 g |
| MES |
97.6 g |
| SDS |
10 g |
| EDTA |
3 g |
| 去離子水 (使用8 M NaOH或8 M HCl調(diào)pH至7.3) |
加至1000 ml |
10x
MOPS 電泳緩沖液配方:
| Tris base |
60.6 g |
| MOPS |
104.6 g |
| SDS |
10 g |
| EDTA |
3 g |
| 去離子水 (使用8 M NaOH或8 M HCl調(diào)pH至7.3) |
加 至 1000 ml |
| 樣品處理： |
| 蛋白樣品 |
x μl |
| 蛋白樣品緩沖液 (5x) |
2 μl |
| 去離子水 |
加 至 10 μl |
| 上樣前將樣品加熱至100℃，十分鐘。 |
非變性PAGE凝膠電泳SurePAGE 預(yù)制膠的pH為6.4，SurePAGE 不含SDS 可用于酸性蛋白(pI＜6.4)的非變性電泳，但不能用于堿性蛋白的非變性電泳。要想獲得理想的電泳結(jié)果，需要您對(duì)樣品蛋白的結(jié)構(gòu)做分析， 對(duì)電泳時(shí)間和電泳緩沖液的pH做一個(gè)摸索。
5x sample buffer:
| 甘油 |
5.0 ml |
| 溴酚藍(lán) |
25 mg |
| Tris base |
150 mg |
| 去離子水 (使用8 M NaOH 或8 M HCl 調(diào)pH至6.8) |
加 至 10 ml |
1x MES 電泳緩沖液配方:
| Tris base |
6.06 g |
| MES |
9.76 g |
| EDTA |
0.3 g |
去離子水
(使用8 M NaOH 或8 M HCl 調(diào)pH 至7.3) |
加至1000 ml |
10x
MOPS 電泳緩沖液配方:
| Tris base |
60.6 g |
| MOPS |
104.6 g |
| EDTA |
3.0 g |
| 去離子水 |
加至1000 ml |
注意事項(xiàng)：金斯瑞提供的電泳緩沖液粉末（Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder，目錄號(hào)： M00138）含有SDS，所以
不適合非變性電泳。
| 樣品處理 |
| 樣品 |
x μl |
| 蛋白樣品緩沖液(5x) |
2 μl |
| 去離子水 |
加至10 μl |
| 不要加熱。 |
電泳過(guò)程：讓上樣槍頭的尖端垂直插入到上樣孔中能夠獲得最佳的上樣效果，槍頭不能戳破膠體，更不能使膠板變形導(dǎo)致樣品漏孔（見(jiàn)圖5）
注意事項(xiàng)：最佳上樣量必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定，樣品過(guò)量會(huì)導(dǎo)致條帶的拖尾和失真。加入過(guò)量的含自由狀態(tài)碳水化合物的蛋白，可能會(huì)導(dǎo)致條帶變形或者蛋白無(wú)法穿入膠中（見(jiàn)故障診斷）。
將電泳槽蓋子蓋好，并將電源線插頭插入電泳儀電源插孔（紅對(duì)紅，黑對(duì)黑），在140 V 電壓下電泳 45-55分鐘直至溴酚藍(lán)條帶跑到凝膠底部（見(jiàn)表3）。
| 電壓 |
開(kāi)始電流 |
結(jié)束電流 |
電泳時(shí)間* |
| 140 V |
75-100 mA |
30-50 mA |
45-55 分 鐘 |
| *凝膠的電泳時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)室的溫度，這些電泳時(shí)間是依據(jù)實(shí)驗(yàn)室中20℃的MOPS、MES緩沖液得來(lái)的 |
重要注意事項(xiàng)：
- 確保使用兼容的電泳槽，內(nèi)外槽之間液體的泄漏會(huì)導(dǎo)致低遷移率（見(jiàn)故障診斷）。
- 電泳時(shí)間可能會(huì)改變，取決于電源和凝膠濃度。
從膠板中取出凝膠（見(jiàn)圖6）
- 電泳結(jié)束后，根據(jù)電泳槽制造商的使用說(shuō)明從電泳槽中取出預(yù)制膠。
- 通過(guò)撬具或其他合適的工具小心的插入到膠板之間的空隙。
- 用撬具慢慢地上下撬動(dòng)膠板，重復(fù)上述操作，撬動(dòng)上、中、下三個(gè)不同的位置，直至膠板兩側(cè)被完全分開(kāi)。注意小心并最好佩戴護(hù)目鏡，以免發(fā)生人身傷害。
- 打開(kāi)之后，凝膠可能粘在膠板的任意一側(cè)，將無(wú)凝膠的膠板取下，將有凝膠的膠板上有膠一側(cè)浸入水中貼著水面，膠板傾斜輕輕提起，凝膠掉入水中后，將凝膠從水中取出進(jìn)行染色（使用后的膠板和梳子請(qǐng)以醫(yī)療垃圾或?qū)嶒?yàn)廢棄物處置，不可投入生活垃圾桶中）。
圖6. 打開(kāi)膠板取出凝膠
